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壳聚糖和聚乙烯亚胺及其衍生物作为基因载体的若干基本问题的探讨

2021-05-17 10:15:54    651次浏览

近年来,随着遗传病和癌症等疾病的发病率进一步上升,阳离子聚合物(polycation)等因可作为基因载体而用于基因治疗,受到人们越来越多的关注。带正电荷的阳离子聚合物可以与带负电荷的DNA相互作用并形成复合物(polyplex),适用于基因转染。与病毒载体相比,虽然阳离子聚合物介导的基因转染效率较低,但具有易制备、易保存和低免疫原性等优点,具有非常重要的研究意义和广阔的应用前景。从来源上说,这些阳离子聚合物主要包括两大类,即合成高分子如聚乙烯亚胺(PEI)和天然高分子如壳聚糖(chitosan)。这些阳离子聚合物大都有一定的转染效率(以PEI为对照),然而,关于其具体的作用机理等一些基本问题的研究尚存不足。本论文以这些常见的阳离子聚合物及其衍生物为例,对若干现存问题进行了深入的探讨,具体工作如下所述。1.以O-未甲基化N,N,N-三甲基壳聚糖(TMC)为研究对象,研究了阳离子聚合物链长度和转染率的关系,并探讨了影响这一结构/功能关系的因素。一般而言,链长较长的阳离子聚合物介导了较高的转染率,然而,对壳聚糖及其衍生物(如TMC),已有的文献报道中并不符合这一规律。我们在合成了四种链长度不同的O-未甲基化TMC的基础上,对其结构进行了明确的表征。由于在制备这些TMC的过程中基本不发生副反应,因此适合对其结构/功能关系的研究。通过荧光素酶(luciferase)在非洲绿猴肾细胞(COS-7),人胚肾细胞(293T)和人非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299)中的表达以及绿色荧光蛋白(EGFP)在293T细胞中的表达,发现分子链越长的TMC介导的转染效率越高,即TMC也符合链长较长的阳离子聚合物介导了较高的转染率这一规律。究其原因,发现其主要的影响因素包括polyplex的稳定性、内吞方式和细胞内转运途径,而非阳离子聚合物与pDNA的结合能力、polyplex的粒径、zeta-电势、血清、细胞毒性或内吞效率。值得注意的是,通常认为影响转染效率的因素,如细胞毒性和内吞效率,并不影响这一结构/功能关系。因此,在制备阳离子聚合物特别是壳聚糖基阳离子聚合物作为基因载体时,应特别注意polyplex的稳定性、内吞方式和细胞内转运途径。2.以PEI及其衍生物为研究对象,研究了它们在有血清和无血清测试条件下最优氮磷比(N/P比,阳离子聚合物中氮的摩尔含量与DNA中磷的摩尔含量之比;最优N/P比即转染效率最高时的N/P比)的变化,以及其他一些可能影响最优N/P比的因素。在己有的报道中,阳离子聚合物的转染效率大都在不同条件下采用特定的N/P比(或质量比)进行检测。但实际上,随着条件的不同,其最优N/P比(阳离子聚合物介导的基因载体的转染效率达到最高时的N/P比)也会不同。因此,若采用若干特定的N/P比进行研究,结论可能不甚合理。本文就这一问题通过PEI及其衍生物进行了深入探索。研究中所合成的PEI的衍生物包括甲基化PEI、季胺化PEI、乙酰化PEI、丙氨酸改性的PEI、赖氨酸改性的PEI、PEG化的PEI、胍化的PEI及咪唑基团改性的PEI等,通过NMR和元素分析等对这些PEI的衍生物进行明确的表征。在COS-7细胞中的转染实验结果表明,PEI及其衍生物的最优N/P比各自不同,例如未改性的PEI的最优N/P比在6-10,而丙氨酸改性的PEI的最优N/P比在40-80,PEG化的PEI的最优N/P比不小于100。另一方面,与无血清存在的条件下相比,有血清时这些最优N/P比将显著变大,例如在10%血清条件下,未改性的PEI的最优N/P比在20-30,丙氨酸修饰的PEI的最优N/P比不小于100,PEG化的PEI的最优N/P比不小于250,等等。同时,通过研究相应的测试条件对PEI转染率的影响,发现polyplex的制备条件、复合物的剂量、培养基的添加物及细胞系的种类同样会影响其转染率和最优N/P比。因此,我们认为,在测定阳离子聚合物作为基因载体的转染效率时,应充分认识到测试条件与最终结果之间的关系。特别是将PEI用作对照时,需证明并采用PEI的最优条件。3.以TMC/pDNA polyplex (TMC-P)和PEI自由链(PEI-F)为研究对象,探讨了阳离子聚合物自由链在其介导的基因转染中的作用。一般而言,在N/P比较低时,阳离子聚合物便能和pDNA形成较稳定的polyplex;而较高的转染效率只有在N/P比较高时才能达到。因此,有一部分阳离子聚合物自由链对有效的基因转染起到了非常重要的作用。由于PEI-P在细胞培养基中不稳定,当探索阳离子聚合物自由链所扮演的角色时,以PEI-P/PEI-F为研究对象并不能很好地排除二者的相互作用。但是,TMC-P/PEI-F的研究体系在DMEM中却非常稳定,且采用不同种类的polyplex和自由链,能够更好地研究自由链的功能。通过TMC-P/PEI-F介导的荧光素酶的表达,我们发现PEI-F能有效提高TMC-P的转染效率。通过在含有细胞内吞通路抑制剂情况下的基因表达,我们发现网格蛋白抑制剂对PEI-P/PEI-F有明显的抑制效果,对TMC-P/TMC-F无抑制效果,然而对TMC-P/PEI-F则有一定的抑制效果;此外,质子泵抑制剂对TMC-P/PEI-F的抑制效果也介于PEI-P/PEI-F和TMC-P/TMC-F之间。可见自由链能明显影响polyplex的内吞方式和细胞内转运途径。此外,这些阳离子自由链本身作为高分子治疗(polymer therapy)的一种方式值得进一步深入研究。事实上,阳离子聚合物介导的基因转染是一个极为复杂的过程。从聚合物结构的设计,到polyplex的制备和运输,再到与靶细胞的识别和内吞,乃至细胞内的转运,最终到达细胞内靶位并产生作用,整个过程都需要精心的构思与细致的设计,但这些均建立在对基因转染整个过程深入了解的基础之上。因此,本论文不仅就阳离子聚合物作为基因载体的若干基本问题进行了深入的研究和探索,其结果也为合理设计及表征用于基因载体的新型阳离子聚合物提供了理论基础和实验依据。